Sunny北加の日記

全員に公開(未登録会員含む)

2016年
10月22日
09:52

GIST診断時の二次変異はどうしてPCR検出ができないのか 耐性 [4]

この課題を説明してくれるサイトは見つからないので、基本的な情報を集め、「GIST診断時の二次変異はどうしてPCR検出できないのか」に答えます。間違いがあれば指摘して下さい。また質問、デイスカッションを多いに歓迎します。
GISTのゲノム変異はPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)法で検出されています。

「PCR法」は多くのサイトで説明されています。その一つ:
PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)法 (日本語です。)
http://www.aichi-c.ed.jp/contents/rika/koutou/seibutu/se1...
のアニメ動画をクリックすると分かりやすく説明されています。

Wiki日本語版の「ポリメラーゼ連鎖反応」の初部文章を編集しました: 
PCR法を使い、非常に微量な検体から、その目的の特定DNA断片(数百から数千塩基対)を選択的に温度変化のステップを30回ほど繰り返すことで目的DNA断片を10億倍ほどに増幅ができる。増幅に要する時間は2時間程度と短く、プロセスが簡単で、卓上用装置で自動的に増幅した結果の塩基配列の詳細が解析できる。

PCRは正しく使へば非常に正確です。目的のExonの解析にはそのExonの前後になる特徴的なプライマー2つ(塩基20-30個の配列)と他の二つの物質が必要です。 GISTの場合、Exon 9、11, 13、14、17などの変異を検出するにはそれらゲノム断片の前後に通常存在するゲノム塩基配列を複製してプライマーとして使われます。

耐性になる二次変異は主に、Exon13, 14, 16そして 17です(1) 。これらを検出するPCRの正確度はプライマーの質、検体の状態などにも影響されるようですが、非常に高いです。問題はPCRの検体にこれら二次変異を有する細胞が入っているか ーです。これは単純な物理的な問題です。これを数値的に追及します。単純な理由は:

1.耐性 [3]で書いたように、初期に二次変異が起こるのは1億か10億個のGIST細胞の中の1個か数個。すなわち極、ごく少量です。
2.PCR法でつかわれる検体の量はDNA100ng ほどをふくむ1.2㎜^3とすごく微量です (2)。これは腫瘍径が5㎝だと全体の37,000分の1の組織量です。

ですから、初発GIST腫瘍のFFPEパラフィンブロックを削った検体に二次変異をおこした細胞が入っている可能性は何万分の1以下です。現実的に二次変異を見つけることが不可能に近いでしょう。 非常に正確なPCRでも、ないものは検出、解析はできないのが現実でしょう。

この件につき、GSIのサイトで質問があり、その一人のChristineさんの私からの質問に答えてくれたメール文章を下にコぺしました。
" Two years ago I asked Dr. Heinrich if the Gleevec resistant mutations are pre-existing, then why they are not detected in tumor samples. He said that the mutation could be 1 out of billions of cells, so a PCR machine may not be able to detect it."
「Dr. Heinrichにもしグリベック耐性変異が既存であれば、どうして腫瘍サンプルから検出されてないのですかと二年前に尋ねました。彼は、突然変異は10億の細胞うち1個の頻度だから、PCRがそれを検出することができないかもしれない。」 

Dr. HeinrichはOHSU(Oregon Health Science University)のGIST治療研究でアメリカ屈指の医師です。

彼の、「PCRがそれを検出することができないかもしれない」は非常に単純な物理的、確率的な課題だとの私の結論です。この件につき、チャレンジまたはデイスカッションを多いに歓迎します。

(1) Secondary mutations in the kinase domain of the KIT gene are predominant in imatinib-resistant gastrointestinal stromal tumor
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1349-7006.20...

(2) ホルマリン固定・パラフィン包埋(FFPE)組織からのmicroRNA 発現プロファイルの作製
http://www.gene-lab.com/miRNA/CF_%E3%83%9B%E3%83%AB%E3%83...
GIST患者コミュニティ「GISTERS.net」」は、「SNS作成サービス!そーしゃるぱーく(無料)」で作成された、PC(パソコン)・FP(フィーチャーフォン※ガラケー)・SP(スマートフォン)・TB(タブレット)対応のSNS(ソーシャル・ネットワーキング・サービス)です。
広告等のお問い合わせは「各種お問い合わせ」までお願い致します。
  • このエントリーをはてなブックマークに追加

そーしゃるぱーくは、数か月後に大幅リニューアルを行います。その作業過程により何かしらの不具合等が発生する場合がございます。ご了承ください。※不具合を発見された場合はお手数ですが、お問い合わせ(無料版)からご報告いただければ幸いです。